液相色譜是根據(jù)不同溶質(zhì)在流動相和固定相之間保留的差異進行分離和測定的方法。通常用容量因子k·來表征溶質(zhì)保留值得大小，k，=(tR-t0)/t0，k·

越大則該物質(zhì)保留越強。容量因子k·隨固定相、流動相濃度c、溫度的不同而變化。在固定相溫度不變的情況下有以下關(guān)系式：

lnk·=-Zlnc+b(Z和b為常數(shù))

由此可見，隨流動相濃度c增加，容量因子k·減小。Z是每種物質(zhì)的特征參數(shù)，小分子Z一般為3-5，大分子Z一般為10-100。對于小分子的樣品，我們可以通過采用合適濃度的流動相來使每種物質(zhì)得到分離，即平常所用的等度液相色譜分析。若對于一個既有小分子，又有大分子的樣品（如含聚合物），由于Z相差較大，在相同的流動相濃度下，容量因子k·差距就非常大，簡單的講，在等度情況下，有時小分子的保留時間在4-5min，大分子保留時間可能在100min以上，更有甚者在有限的時間內(nèi)不出峰。

二元高壓分析梯度液相色譜儀梯度分析法就是為解決這個問題產(chǎn)生的。它是采用特殊的設(shè)備使流動相的濃度隨時間變化，對保留弱的用濃度小的流動相，對保留強的用濃度大的流動相，使各組分較為均勻的流出。例如對于某樣品用60％流動相、80％流動相和梯度（30min內(nèi)從60％-100％）的分離效果如下。

從上可以看出用60％流動相分離效果好，但用時150min，用80％流動相分離效果已經(jīng)很差了，用時仍達80min，而用梯度的方法分離效果很好，用時只有50min，另外，保留時間長的色譜峰沒有明顯變寬。

2.二元高壓分析梯度液相色譜儀設(shè)置方法

通常有兩種梯度方式，一種是低壓梯度，一種是高壓梯度。低壓梯度只用一個輸液泵，靠梯度單元中電磁閥開關(guān)時間的比例來控制AB液的比例實現(xiàn)流動相濃度的變化，例如需控制A:B=40:60，在很小的時間段如1秒，CD閥常關(guān)，A閥開4/10秒，B閥開6/10秒，任意時間四個閥只有一個開，輸液泵流出的流動相AB液是一節(jié)一節(jié)相連的，經(jīng)混合器混合成一定比例的流動相。低壓梯度zui多可有四種流動相。

3.二元高壓分析梯度液相色譜儀注意事項及常見故障排除

1.更換流動相后，要用新流動相沖洗管路和脫氣機。

2.及時觀察兩個泵的壓力變化。如壓力變化過大，通常是其中一個泵抽空或不流液。

打開放空閥，用注射器在廢液管端吸，使排液順暢。

3.通常情況下，梯度基線是逐漸升高的，但如出現(xiàn)較大的鼓包是不正常的。原因很

多，可先用純甲醇沖洗整個儀器管路，或更換新配的流動相。

4.注意開機順序，依次是監(jiān)測器，付泵，主泵，脫氣機。有時會出現(xiàn)主泵控制不上

付泵的情況，可按主泵PUMP鍵測試，正常情況是按主泵PUMP鍵，付泵應與主泵同時開或關(guān)。出現(xiàn)錯誤時可將付泵再開一次。

5.梯度方法由于流動相的純度等問題易出現(xiàn)鬼峰，做完樣品后應打空白，樣品不積

空白中出現(xiàn)的峰。

6.100％水的流動相勤用勤配，防止霉變。